無菌 藥品在使用前的無菌保證，是藥品管理法規(guī)的要求。因此，必須有容器完整性（Container Closure Integrity-CCI）的驗證和監(jiān)測，以確保在無菌藥品生產，質控，運輸和儲存，乃至產品有效期的整個生命周期過程中，產品不受微生物的污染，確保病人用藥安全。目前各個國家的藥政法規(guī)，都有提供容器完整性CCI的測試方法，但是沒有提供具體細節(jié)，指導如何合理的選擇方法，及評價一個無菌藥品包裝系統(tǒng)( Container Closure System-CCS)的完整性。方法的合理選擇，以及科學的制定一個可接受的標準，和產品的性質和包裝系統(tǒng)密不可分。歐洲醫(yī)藥同盟多次開會探討容器完整性測試的最佳方法，卻得出結論，并不存在容器完整性測試的一個黃金標準，在考慮無菌制劑的既定用途和產品設計的基礎上，需要采取一個靈活的方法，來評估產品的包裝容器完整性。

   美國藥典修訂了容器完整性測試（Container Closure Integrity Testing-CCIT）的通則方法USP<1207>。這個修訂緣于上世紀70年代的一個醫(yī)療事故，當時美國雅培工廠的一個靜脈輸注產品的包裝系統(tǒng)做了更換，在醫(yī)院注射此產品的病人廣泛爆發(fā)敗血癥，導致10%的病人因此死亡，經調查證實更換的包裝系統(tǒng)存在密封完整性的缺陷，使產品遭受微生物污染。這個悲劇事件，以及不斷提升的藥政監(jiān)管要求，強調了制藥企業(yè)確保無菌制劑包裝完整性的重要性。

方法簡介和選擇依據

   根據USP通則<1207>，將容器密封完整性測試的檢測方法分成確定性和概率性兩種類型。確定性檢測方法包括：高壓泄漏檢測法，激光頂空分析，氦氣泄漏測試，質子流法，壓力衰減法，真空衰減法，和Corona電極放電法。概率性檢測方法包括：氣泡發(fā)射法，色水法，和微生物挑戰(zhàn)法。

   每個方法有其不同的靈敏度以及選擇參考點。制藥企業(yè)需要把包裝系統(tǒng)CCS作為藥品開發(fā)的關鍵質量屬性之一，用質量源于設計（Quality by Design-QbD）的理念，在藥品設計到生產的整個生命周期內，基于不同階段藥品有不同的應用目的，選擇合適的、CCIT方法。在選擇CCIT方法的時候，必須充分理解內包裝的材料特點，制作工藝參數，和操作中的控制方法。此外，對于容器密封性的可接受標準，在不同的產品發(fā)展階段也會有所不同。

在選擇一個合適的容器完整性測試CCIT方法的時候，需要考慮以下因素：

-     方法的既定用途，即，用于包裝系統(tǒng)的開發(fā)和確認，還是商業(yè)生產階段的過程控制或驗證，還是穩(wěn)定性測試；

-       包裝系統(tǒng)開發(fā)前的認知，即，是開發(fā)該產品和包裝系統(tǒng)，還是改進一個新產品的包裝系統(tǒng)；

-       包裝系統(tǒng)的形式，即，小玻璃瓶，注射器，藥品和醫(yī)療器械的復合制劑，還是靜脈點滴用袋子；

-       包裝系統(tǒng)的材料，是延展性材料，玻璃，還是高分子聚合物；

-       藥品的類別，即，液體制劑，凍干粉制劑，小分子產品，還是大分子產品，水相制劑，溶劑制劑，還是油相制劑，產品導電性如何，產品黏度，頂空氣體的組成，常壓，還是真空包裝，或是過壓包裝；

-       測試時間長短的考量；

-       要求的方法靈敏度；

-       樣本做人工泄漏的可行性和人工泄漏方式

-       用于專屬研究的樣本量；

-       樣本制備的考量，以及樣本制備帶來的潛在風險，比如需要移除標簽，或需要排空小瓶，或需要清潔小瓶。

在很多情況下，包裝密封性測試方法的最初選擇，是基于某特定測試技術的經驗。隨著制藥企業(yè)經驗的積累，類似產品或包裝的參考，還有文獻的參考，以及行業(yè)標準和指南文件的指導，在產品開發(fā)到發(fā)展的整個生命周期，會采用不同的測試方法。在測試方法選擇上，還需要考慮以下因素：

?對測試樣本的破壞性還是非破壞性；

?測試的方法是內聯(lián)，在線，離線，還是近線；

?測試的有效性考量，包括測試速度（比如單位時間內的測試量），測試的產出（包括樣本平衡的時間和控制組的測量）

? 測試頻率和計劃：只需要測試一次還是需要多次，比如需要在穩(wěn)定性方案中測試（氣體滲透的潛在影響）；

?測試成本，包括設備的購買，方法和設備的驗證，測試條件的維護成本；

?用于測試裝載的包裝系統(tǒng)，還是空載的包裝系統(tǒng)

?是否干擾藥品的理化測試；

?方法操作的特點：靈敏度，方法的耐用性，精密度，和準確度；

?測試結果的表述方式：通過/失?。?，判定是否存在超過方法靈敏度的泄漏），泄漏位置的標記，還是能定量的測出泄漏孔的大小或泄漏流量；

? 泄漏樣品帶來的設備污染風險。

  不管選擇哪個測試方法，測試儀器都需要經過校驗，測試方法也需要通過驗證，測試方法的系統(tǒng)適用性試驗，應該包括陽性控制（即已知泄漏的樣本）和陰性控制（即沒有人工泄漏的樣本）。

方法特點和應用范圍

下文將對各種常見測試方法的優(yōu)缺點和應用范圍做詳細探討。

1）高壓泄漏檢測法

   High-voltage leak detection

這是一種確定性的泄漏測試方法。高壓電檢漏是基于定量的電導測試，要求容器內灌裝的液體有一定的電導率，在待檢品上外加高壓電，泄漏點的存在導致樣品電阻的下降，從而導致電流的突躍，當然這個電流應該大于預先確認的方法檢測閾值（通過/失敗判定的靈敏度）。

該方法的優(yōu)點：

-       不需要破壞樣本

-       可以做到100%的在線測試

-       高速的測試

-       不需要測試前的樣品制備

-       其準確性獨立于員工的操作技能

-       在常壓下測試

該方法的缺點：

-       只有通過/失敗兩種結果，沒有定量的結果

-       藥品本身的電導應該大于包裝材料的電導

-       有可能破壞到產品（比如引起蛋白質的降解）

-       制劑液體必須不是易燃液體

-       測試過程會產生臭氧

-       對于特定的包裝系統(tǒng)，需要的固定裝置

-       電極必須離泄漏點在一定的距離內

-       藥品液體需要和泄漏點接觸或者非?？拷?/p>

-       產品堵塞泄漏孔會導致測試結果不準確

-       不適用于凍干粉制劑產品

該方法的應用范圍和建議：

-       對于商業(yè)化生產線的高產出的檢測。

-       需要評估產品接觸到高壓后的質量影響。

-       在長期穩(wěn)定性樣品的泄漏測試上受限，這主要是由于長期儲存過程中液體風干堵塞泄漏孔。

-     產品的電導可能不足以檢測出泄漏

-     可以把100%的在線檢測模式整合到自動目測檢查的生產線中。

-       在100%的在線測試中依舊受到限制，這主要是由于方法有其靈敏度，只能測試到大于靈敏度的泄漏。

-       當泄漏點在小瓶的頂端位置，比如在閘蓋處，沒有和液體產品接觸到，該方法就不適用。

2）激光頂空分析

   Laser-based headspace analysis

這是一種確定性的泄漏測試方法。激光法是通過監(jiān)測容器頂空壓力、水汽和頂空氧變化來判定容器的完整性，原理是發(fā)射的激光穿透容器頂空，容器頂空的水汽和氧對激光有吸收，激光吸收量和對應的物質含量成正比。頂空水汽的吸收峰寬度和頂空壓力成正比，因此可以通過頂空水汽的吸收峰寬來獲得頂空壓力。

該方法的優(yōu)點：

-       不需要破壞樣本

-       可以做到定量測試

-       可以做到100%的在線測試

-       高速率的測試

該方法的缺點：

-       包裝容器必須是透明的

-       需要在包裝瓶的頂空有可以改變的氣體環(huán)境

-       需要頂空部位有一定的空氣體積供于檢測

-       在探測小尺寸的泄漏上，會延長測試的時間

-    變更設備的部件時需要包含所有不同的尺寸和型號

該方法的應用范圍和建議：

-       對于微米級孔徑大小的泄漏，測試可能需要耗時幾周的氣體交換。

-       測試方法方便使用

-       可用于評估瞬間發(fā)生的泄漏（比如測試需要低溫儲存的產品）

-       有可能導致錯誤的測試結果，尤其是在穩(wěn)定性研究中，由于氣體的滲透或被液相吸收。

-       由于快速的和環(huán)境壓力平衡，大尺寸的泄漏可能無法測出（比如測試低溫儲存的產品）。

-       不容易區(qū)別出不同尺寸的泄漏。

-       不容易甚至不能夠測試出在液面下的泄漏，因此，只適用于預灌注注射器。

-       凍干粉制劑產品可能會導致泄漏的堵塞。

-       有部分的壓力依賴于溫度。

3）真空衰減法

   Vacuum decay

這是一種確定性的泄漏測試方法。真空衰減法是將包裝容器置于專門的測試腔體內，對測試腔體抽真空，容器內外壓差使得容器內部氣體通過漏孔泄漏進入測試腔體，主機壓力傳感器監(jiān)測到壓力的變化，將壓力變化值和參考值做比較，壓力增大說明存在泄漏，以判定容器密封完整性是否格。此方法的測試步驟包括：抽真空、保壓和測試。

該方法的優(yōu)點：

-       不需要破壞樣本

-       可以做到100%的在線測試

-       高速率的測試和產出

-       測試不會影響生產進度

-       有ASTM方法可供參考（ASTM-American Society for Testing and Materials）

-       可適用于液體和凍干粉的制劑

-       可應用于有色包裝瓶和貼好標簽的包裝瓶檢漏

該方法的缺點：

-       儀器昂貴，每種包裝系統(tǒng)需要特定的儀器腔體

-       產品堵塞泄漏孔的情況下會檢測不出泄漏

-       真空腔體的準備至關重要（濕度會影響測試結果）

該方法的應用范圍和建議：

-       此方法適用性很廣，可用于支持產品開發(fā)，商業(yè)化，以及穩(wěn)定性研究各階段，包裝容器的密封性檢查。

-       適用于液體和凍干粉的制劑。

-       可應用于包裝器械的測試，和貼好標簽的包裝瓶檢漏。不過，相對于未貼標簽的初級包裝，其檢測靈敏度是降低的。

-       只限于在線測試，并會產生假陽性結果（比如，當有滯留氣體在閘蓋處時；或者受到濕度波動的影響時）。

-       方法開發(fā)研究表明，該方法對凍干粉，預灌注液體的注射器，和小容量瓶液體制劑具有等同的靈敏度。

-       當應用于液體制劑時（黏度限制），鐳射穿孔的陽性控制樣本容易出現(xiàn)堵塞的情況；對預灌注注射器，細孔也很容易被蛋白質或硅油堵塞。

-       壓力變化和泄漏的尺寸，泄漏的速率有量級的相關性。然而，無法區(qū)分泄漏是來自于多個泄漏小孔還是單個，或者是包裝連接處的裂縫。

4）微生物挑戰(zhàn)法(浸入或氣溶膠挑戰(zhàn))

   Microbial immersion or aerosol challenge

這是一種概率性的泄漏測試方法，此檢查通常與模擬灌裝同時進行。通過按照模擬灌裝驗證方案進行培養(yǎng)基模擬灌裝，然后進行壓塞軋蓋后，目檢合格，經已驗證的滅菌柜滅菌后，將容器密封面浸入到高濃度的菌液中，使樣品容器內的培養(yǎng)基充分接觸封口內表面，樣品的頸部及封口的外表面應*浸泡在菌懸液中，浸泡一定時間后取出，定期培養(yǎng)后檢查是否有微生物侵入，以確定容器密封系統(tǒng)的完整性。同時，需要做陽性對照試驗，確認培養(yǎng)基的促生長能力。測試中通常會運用真空或過壓的挑戰(zhàn)條件。

該方法的優(yōu)點：

-       數十年來獲得廣泛應用。

-       是整個行業(yè)和法規(guī)熟識的做法。

-       可以與模擬灌裝結合，同步進行。

-       對產品特性的直接評價（即，確保容器密封性可以使產品免受微生物污染）。

該方法的缺點：

-       對樣品的破壞性。

-       只有通過或失敗的結果，沒有定量測試。

-       不可能進行100%的樣本測試。

-       測試會耗時數周。

-       需要比較多的勞動力。

-       只能適用于可以做培養(yǎng)基罐裝的包裝系統(tǒng)。

-       可能會導致假陽性或假陰性的結果；測試的靈敏度部分依賴于分析員的操作技巧。

-    對于微小瑕疵，測試具有隨機性。

-    不同國家地區(qū)，對于培養(yǎng)基，所用菌種和測試方法還沒有統(tǒng)一。

該方法的應用范圍和建議：

-       此方法的檢測限隨著以下因素波動：泄漏的大小，包裝材料，菌種，培養(yǎng)基和挑戰(zhàn)條件。

-       一直被用來建立關鍵的泄漏點（根據其泄漏的速率或大?。?/p>

-       浸入法比氣溶膠挑戰(zhàn)法更普遍，方法條件更容易達到，有更好的重復性。

-       不使用真空或過壓的條件，自然放置幾周時間再檢查，更具有代表性，不過耗時。

-       如果使用真空或過壓的條件，可以加速測試，數小時內就可以做檢查，這種方式可以代表運輸條件，減少測試時間。

5）染色浴法

   Dye ingress

這是一種概率性的泄漏測試方法。將密封容器*浸沒在染色浴中，也可在染色浴中加入表面活性劑，對整個測試腔體進行抽真空。如果該容器有裂縫，空氣就會從瓶中溢出。然后解除真空，這時泄漏容器內存在負壓，染色溶液會從裂縫中進入瓶內部，再對測試腔體加正壓，提高染色液的滲入性，通過分析員或儀器目檢剔除變色的容器。

該方法的優(yōu)點：

-       數十年來獲得廣泛應用。

-       有ASTM和ISO的標準方法。

-       是整個行業(yè)和法規(guī)熟識的做法。

-       基礎并且有效率。

-       可靈活應用，同時測試不同包裝容器的泄漏情況。

-       可以看出泄漏的位置。

-       泄漏位置可以在液相中。

該方法的缺點：

-       對樣品的破壞性。

-       只有通過或失敗的結果，沒有定量測試。

-       不可能進行100%的樣本測試。

-       必須是透明的包裝系統(tǒng)，用于目測判斷。

-       如果樣品體積本身比較大，只進入很少的染色水，有時不容易分辨出來。

-       對于微小瑕疵，測試具有隨機性。

該方法的應用范圍和建議：

-       方法具有多用途，可以測試初級包裝和外包裝，用來支持產品開發(fā)階段，商業(yè)化生產，和穩(wěn)定性研究階段的檢漏測試。

-       直接檢測相關泄露

-       可以運用不同的染色劑。

-       如果運用優(yōu)化的真空/加壓循環(huán)工藝，可以提高測試的靈敏度。方法的檢測限隨著以下因素波動：泄漏的大小，包裝材料，染色液的濃度，和挑戰(zhàn)條件。

-       染色液必須是易混合的而且不和產品發(fā)生化學反應。

-       可以把同樣的挑戰(zhàn)條件應用到微生物侵入試驗法中。

-       對于液體制劑應用良好，但基于染色液的限制，可能對凍干制劑不適合 。

人工穿孔的技術討論

上述討論的檢漏方法，都需要做方法驗證，需要有明確泄漏的樣本來做陽性控制，以挑戰(zhàn)方法的檢漏能力。對于樣品的人工穿孔，有以下幾個常用的方法：

-       鐳射穿孔，直接穿透包裝容器本身

-       鐳射穿孔，穿透在和包裝容器相連的金屬片或管 （laser drilling into a metal plate or tubing that is integrated to a CCS ）

-       微米級的金屬絲插入到容器中

-       微量吸管插入到膠塞或連接到容器的一個人工小孔上

-       毛細管（熔融硅，鎳或玻璃）插入到膠塞或連接到容器的一個人工小孔上。

每一種方法都有其挑戰(zhàn)性，包括穿孔尺寸的限制，穿孔形狀不規(guī)則，穿孔大小難以測量，微小穿孔容易被立即堵上，造價高等等。目前行業(yè)內沒有標準來規(guī)定穿孔技術和孔徑測試的方法。在建立容器密封性測試方法的時候，每個公司需要對自己建立的方法做合理性的說明，采用適當的方法。

結論

隨著修訂版USP<1207>的執(zhí)行，對于包裝容器密封性測試（CCIT）會有更多深入的調查，生產無菌制劑的企業(yè)需要符合不斷發(fā)展的法規(guī)期望。對于CCIT的測試方法和可接受標準，目前行業(yè)給予企業(yè)一定的靈活性。正如上述討論，每個方法都有其優(yōu)缺點和適用性，市面上的測試儀器也有其各自的優(yōu)缺點，因此，制藥企業(yè)有責任根據產品自身的特點和產品的不同發(fā)展階段，采用風險評估的方法，選取并驗證合適的檢漏測試方法，并建立泄漏的可接受標準。

表1. 五種泄露檢測法綜合評價

表2. 五種泄露檢測法詳細描述